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高純度中量質粒DNA純化試劑盒

快速中量質粒DNA純化試劑盒，為分離高質量質粒DNA提供了一種快速，簡便，可靠的方法。該試劑盒設計在20分鐘內純化多達100μg的質粒DNA，具有簡單有效的方案，提取出適用于分子克隆或其他下游應用的超純質粒DNA

質粒是環狀的染色體外DNA分子，在分子生物學中充當特定DNA片段的載體。再通過細菌來復制質粒，從而可以大規模生產所需的DNA。研究人員從細菌中獲得質粒的方法稱為質粒提取。

從細菌細胞中提取質粒DNA是克隆的關鍵步驟。細菌細胞在質粒純化過程中被裂解，從而讓細胞中DNA和其他生物成分釋放出來。在去除掉大多數細胞成分后，將含有質粒DNA與基因組DNA的DNA的裂解液進行分離。

提取的質粒DNA的質量與通過兩次通過氯化銫梯度純化產生的質粒DNA的質量相同，這是DNA純化最傳統的方法。高質量的DNA可以在不到二十分鐘的時間內被提取，用于轉染和其他應用。不需要額外的過程來去除RNA，蛋白質或內毒素等雜質。此外，《使用說明》操作過程不需要使用苯酚、氯仿、溴化乙錠和氯化銫，減少了有害化合物的暴露和處置。

原理和工作流程（圖1）

BcMag ? 高純度中量質粒DNA純化使用弱陰離子交換磁珠快速純化質粒DNA。磁珠可以與質粒DNA直接結合。這種方法使用傳統的細胞懸浮，堿性裂解和中和過程，并將質粒DNA直接結合到磁珠上。再對磁珠進行清洗去除雜質，如RNA，蛋白質，代謝物和其他低分子量分子。獨特的清洗緩沖液可確保消除無機鹽，蛋白質，RNA和其他生物成分，從而獲得濃縮的高純度DNA。隨后用高鹽緩沖液洗脫高純度的質粒DNA。再對DNA進行脫鹽，用異丙醇沉淀洗脫的質粒濃縮，然后離心。整個提取過程大約需要20分鐘才能完成。

功能和優點

· 操作簡單-不需要離心柱或過濾器。

· 快速-在不到二十分鐘的時間內純化質粒DNA。

· 無需苯酚/氯仿萃取

· 低內毒素

· 高質量-DNA適用于大多數下游應用

· 可輕松調整提取樣本反應體積，便于自動化操作

· 可重復的結果

操作協議

所需材料

A. 緩沖液組成

· 所需材料：BcMag? 質粒提取DNA磁珠。

· TE緩沖液：10mM Tris.HCL PH8  0.1mM EDTA

· 異丙醇（Sigma cat#19516）

· P1（重懸緩沖液）：50mM Tris.HCl，pH 8.0，10mM EDTA，100ug/ml核糖核酸酶A（加入核糖核酸酶A后保存在4℃）

· P2（裂解緩沖液）：200mM NaOH，1%SDS（w/v）

· P3（中和緩沖液）：3.1M乙酸鉀，pH 5.5（保存在4°C）

· P4（平衡緩沖液）：750mM NaCl，50mM MOPS，pH 7.0，15%異丙醇（v/v），0.15%Triton X-100（v/v）

· P5（洗滌緩沖液）：1.0 M NaCl，50mM MOPS PH 7.0，15%異丙醇（v/v）

· P6（洗脫緩沖液）：2.5 M NaCl，50mM Tris.HCl，pH8.5，15%異丙醇（v/v）

B. 所需設備

a. 磁力分離器（手動操作）

根據樣品體積，用戶可以選擇以下磁力架之一：

? BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);

· BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);

· BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);

· BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);

· BcMag 96-孔磁力分離器(單面) 可與96孔PCR板和96孔微孔板或其他型號離心板兼容使用 (Blioclone,  Cat#: MS-06)；

· 對于大規模凈化，陶瓷磁體塊用于大規模凈化（6英寸x 4英寸x 1英寸塊鐵氧體磁體，應用磁體，Cat#Ceramic-B8）

b. 用于大規模純化的康寧430825細胞培養瓶（Cole Parmer，Cat#EW-01936-22）

c. Mini BlotBoy 3D搖床，定速，小型10“x 7.5”平臺，帶平板墊（Benchmark Scientific，Inc.Cat#B3D1008）或同類型產品

C. 操作過程

**該方案基于具有高拷貝質粒的50 ml細菌培養物。然而，該方案可以根據細菌培養量適當放大或縮小。

1. 細菌溶解

a. 將50ml過夜細胞培養物轉移至離心管中，以6000 rpm離心10分鐘，并除去上清液。

b. 用4ml P1緩沖液完全重懸細菌沉淀，輕輕加入4ml P2緩沖液混合，通過緩慢顛倒混勻在室溫下孵育5分鐘。

c. 加入4ml緩沖液P3，通過顛倒輕輕混合，在室溫下以12000-16000 rpm離心10分鐘，并小心轉移上清液。（如有必要，將上清液通過六層粗棉布過濾）至新鮮管中。

2. 質粒純化

a. 震蕩試劑瓶，直到磁珠變得均勻，然后將1ml磁珠轉移到新的試管中。

注意：在分配之前，不要讓磁珠靜置超過3分鐘。每3分鐘重懸一次磁珠。

b. 將試管放在磁力架上1-3分鐘。當樣品板保持在磁力分離器上時，將上清液去除。加入10倍磁珠體積的P4緩沖液，并通過移液或渦旋混合磁珠。再次將試管放在磁性支架上1-3分鐘，當樣品板保持在磁力分離器上時，將上清液去除。

c. 將磁珠與細胞裂解液混合（step1c），在Mini BlotBoy 3D搖床上在室溫下連續旋轉孵育5-10分鐘，然后將試管放在磁力架上1分鐘，直到它變清澈，然后除去上清液。

d. 使用磁力架用6ml P5緩沖液清洗磁珠三次。

e. 向磁珠中加入1ml洗脫緩沖液，并通過上下移液15-20次完全重懸磁珠。將試管置于磁力架上1-3分鐘，并將上清液轉移到新管中。

3. 質粒沉淀

a. 加入700ul異丙醇，充分混合，在室溫下孵育2分鐘，并在室溫下以14000-16000 rpm離心10分鐘。

b. 小心地取出上清液，用600ul 70%乙醇洗滌沉淀，以14000-16000 rpm離心4分鐘，

c. 小心地取出上清液并將沉淀風干5-10分鐘。（**不要過度干燥顆粒。否則顆粒很難分解）。

d. 用所需量的TE緩沖液重懸沉淀。（**在1%瓊脂糖凝膠上運行2-3 ul質粒溶液以檢查質量。如果存在RNA，則添加RNAse A以完全去除RNA）

質粒純化常見問題

你建議什么樣的培養條件？

培養物應從單個菌落接種，并在適當的抗生素存在下在培養基中培養。從起始培養物中進行亞培養也是可行的，但結果可能會有所不同。當培養物從對數期進入穩定期時，應收獲細胞，以確保存在最大量的DNA而細胞裂解最少。單個菌落可用于接種在中高拷貝質粒的正常克隆過程中，于37°C培養12-16小時的5-10 ml培養物。1-3 ml的這種培養物應該可以產生3-6μg的高拷貝質粒或1-2μg的中拷貝質粒。較低拷貝的質粒將導致較低的產量，這可以通過處理較大的培養體積，同時縮放P1-B6緩沖液或濃縮純化的DNA來解決。

什么因素影響質粒DNA的回收？

一些因素可以影響制備前和制備過程中的質粒回收率。質粒拷貝數，質粒大小，插入毒性，宿主菌株，抗生素選擇，生長培養基和培養條件可以影響最終的質粒回收率。適當時選擇高拷貝質粒，并將總大小保持在10kb以下以獲得更高的產量。盡管產量較低，但可以分離出較大的質粒（高達25 kb）。在生長過程中保持抗生素選擇可確保質粒不會丟失，并且培養物不會被沒有質粒的快速增長的細胞群淹沒。適當的通氣和生長溫度確保對數細胞生長，細胞裂解很少。

利用低拷貝質粒時應該怎么做？

通過確保培養物在最佳通氣條件下培養并在主要細胞裂解發生之前除去，增加含有質粒的完整細胞的數量。低拷貝質粒的回收率總是低于高拷貝質粒的回收率。使用更多的細胞可以彌補部分不足，但要遵循這些參數，以確保堿裂解是有效的，并且珠子不會被細胞成分淹沒。

你建議使用哪種文化媒體？

可以使用富媒體，例如2X YT或Terrific Broth。然而，它們通常在飽和時導致更大的細胞密度。因此，當使用富培養基時，必須減少處理的培養物量，以避免由于生物量較大而導致的堿裂解不足和柱超載。我們建議在LB（Luria-Bertani）培養基中培養大腸桿菌。

你推薦哪種大腸桿菌菌株？

最常見的實驗室克隆菌株可用作質粒繁殖的宿主，用于miniprep純化。Thermofisher提供合適的菌株，例如DH5α（Thermo Scientific#18258012）或DH10B（Thermo Scientific#EC0113）。

質粒是否用不含內毒素的珠子回收？

盡管弱陰離子交換珠和緩沖液從樣品中去除了絕大多數內毒素，但回收的DNA不能保證不含內毒素。我們已經成功地用質粒DNA轉染了強大的細胞系。雖然一些制造商可能聲稱他們的minipreps試劑盒是“無內毒素的”，但通常存在一些可定量的內毒素。

質粒miniprep后哪些因素影響my（A260/A280）？