產品中心
PRODUCT CENTER
可分離式NHS活化磁珠
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貨號 |
產品名稱 |
產品規格 |
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II101 |
1μm BcMag? 可分離式NHS活化磁珠 |
150 mg |
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II102 |
1μm BcMag?可分離式NHS活化磁珠 |
300 mg |
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II103 |
2.5μm BcMag?可分離式NHS活化磁珠 |
150 mg |
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II104 |
2.5μm BcMag?可分離式NHS活化磁珠 |
300 mg |
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產品屬性 |
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組成 |
表面接枝可分離式NHS基團的磁珠。 |
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磁珠數量 |
約1.68 x 109磁珠/毫克（1um磁珠） 約5 x 107磁珠/毫克（5um磁珠） |
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穩定性 |
短期（<1小時）：pH 3-11；長期：pH 4-10 溫度：4°C-140°C；大多數有機溶劑 |
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磁力大小 |
40-45 EMU/g |
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磁化類型 |
超順磁性 |
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狀態 |
凍干粉 |
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官能團密度 |
1μm磁珠 |
約250μmole/g磁珠 |
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2.5μm磁珠 |
約235μmole/g磁珠 |
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存儲 |
在室溫下運輸。保存在-20°C，收到后不可受潮 |
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胺基基團（-NH2）是固定蛋白質分子最常見功能基團：該基團可以在每個多肽鏈（稱為α-胺）的N末端和賴氨酸（Lys，K）殘基（稱為ε-胺）的側鏈中找到。由于伯胺基團在生理條件下帶正電荷，因此它們通常分布在蛋白質的外部（即在外表面）；所以在與它們結合過程中，不會使蛋白質結構發生變性。
BcMag ? 可分離式NHS活化磁珠是均勻的，表面涂有高密度NHS（N-羥基琥珀酰亞胺）官能團的磁珠。磁珠利用可靠的NHS酯進行化學固定，不需要使用危險化學品。而且本磁珠具有較低的非特異性結合率，并且不會造成偶聯配體的泄漏。通過形成穩定的酰胺鍵，偶聯效率超過85%，該磁珠可以快速，有效地共價結合任何含伯胺的配體。Bioclone 可分離式NHS活化磁珠反應僅需不到一個小時（在室溫pH 7-9下為15-30分鐘，在4°C下為4小時），就可以產生非常穩定的連接。由于NHS基團通過內置的可切割二硫鍵連接物（圖1）與磁珠連接，因此，可用還原劑（如DTT或β-巰基乙醇）從磁珠上切割并分離出目標分子-配體的復合物。此外，它的親水性表面基團保證了磁珠在實驗過程中，具有極低的非特異性吸附率、且有良好的分散性，并易于在各種緩沖液中處理。
產品獨特的干燥狀態避免了丙酮溶劑儲存的麻煩，或液體去除和處理的需要。此外，由于干基質在膨脹時濃縮樣品，減少了起始材料的體積，并且會提高配體固定化的效率，因此它非常適合與濃度較低樣品進行偶聯反應。
工作流程
本磁珠作為固體載體可以完美地用于各種親和純化，將分子，細胞和部分細胞進行純化。只需要與配體結合后，將磁珠添加到含有目標分子的溶液中，然后混合，孵育，清洗和洗脫目標分子（圖2）
圖2
特點和優勢：
l 預活化，即用型磁珠
l 含有一個可切割的內置二硫鍵，可將配體-目標分子復合物從磁珠中分離出來。
l 配體-目標分子復合物可以從磁珠上分離出來
l 便于使用
l 在pH7.4，4℃-25℃條件下可以快速偶聯
l 穩定的共價鍵，低水平的配體泄漏
l 可重復使用的免疫親和基質
l 極低的非特異性結合率
l 可固定15-20ug蛋白/mg的磁珠
l 用途：用于純化抗體，蛋白質/肽，DNA / RNA;細胞篩選、免疫沉淀
操作協議
提示：
l 強烈建議在實驗過程中進行滴定優化，以確定每個實驗中應用的磁珠數量。該協議可以相應地放大和縮小。
l 避免使用含有還原劑、tris或其他含有伯胺或其他親核類試劑的緩沖液，因為它們會破壞二硫鍵連接物或與預期的偶聯反應競爭。但wash buffers和 storage buffers 可含有氨基或羧基成分。
A.所需耗材
1.磁力分離器（適用于手動操作）：根據實驗時生物樣品的體積，使用者可以選擇一下不同型號的磁力分離器：
BcMag? separator-2可以容納兩個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-01);
BcMag? separator-6可以容納六個單獨的1.5 ml離心管(Cat.# MS-02);
BcMag? separator-24可以容納24個單獨的1.5-2.0 ml離心管(Cat.# MS-03);
BcMag? separator-50可以容納一個單獨的50 ml離心管，一個15ml的離心管，以及四個1.5ml離心管(Cat.# MS-04);
BcMag? separator-96 可以配合96 ELISA板使用 (Cat.#MS-05).
2.Coupling Buffer: 0.1M磷酸鉀，0.15 M NaCl，pH 7.4
3.Wash Buffer: 0.05 M Tris-HCl, 0.5 M NaCl, pH 8.0.
4. Blocking Buffer: 1 M乙醇胺, pH 9.0
B.磁珠的準備
1.用丙酮（30 mg/ml）制備3%的磁珠，并充分混合。
提示：將未使用的磁珠可以在丙酮溶液中，儲存在4℃?？杀４嬉荒陼r間。
2.將100μl（3mg）的磁珠轉移到離心管中。
3. 將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。從磁力分離器上取下試管，加入1ml的coupling buffer用通過渦旋30秒重新懸浮磁珠。
4.重復步驟3 兩次。
5.去除上清液，將清洗的磁珠準備進行耦合反應。
注：使用coupling buffer重新水化后，由于官能團的穩定性，應盡快使用磁珠。
C.蛋白質的偶聯
提示：NHS活化磁珠的偶合效率因配體而異。用戶可應根據經驗優化配體的濃度。蛋白質的建議結合濃度為0.5-10 mg/ml。對于小分子多肽，配體濃度應至少為200μmol /ml。
1.用coupling buffer制備100μl蛋白質溶液（0.5-1mg/ml）或多肽溶液（200μmol/ml）并與上述清洗過的磁珠混合。如果樣品已經懸浮在另一個緩沖液中，用等量的coupling buffer稀釋樣品。
2. 在室溫條件下，連續旋轉孵育4-6小時或者過夜。提示：使用者應該對反應時間進行優化
3.將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。從磁力分離器上取下試管，加入1ml的coupling buffer用通過渦旋30秒重新懸浮磁珠；再將試管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。
4.用1ml的Washing buffer(或者 1 M NaCl)清洗磁珠，重復3-4次。
5. 向磁珠中添加0.5-1ml的blocking buffer(BSA也可以封閉磁珠, PBS, pH7.4, 0.1%BSA)，并在室溫下培養1小時或在4°C下過夜。
6. 用1ml預冷的Washing buffer將磁珠洗滌3次。
7. 用 pH 7.4含有0.1% BSA，0.01%疊氮化物（w/v）的PBS緩沖液重新懸浮磁珠至所需濃度，并在4℃下儲存，直至使用。不要冷凍保存。
D．常見親和純化過程
提示：
l 該方案是一個通用的親和純化發法。因為沒有兩種蛋白質是完全相同的，所以不可能為所有的蛋白質純化設計一個通用的協議。為了獲得最佳結果，每個用戶必須確定純化單個目標蛋白的最佳工作條件。
l 避免在binding buffers 和 washing buffers中使用還原劑。
l 強烈建議根據粗樣品中目標蛋白質的含量，進行滴定，以優化每個單獨實驗
中使用的磁珠數量。使用過多的磁珠將導致較高的背景，而使用過少的磁珠將導致較低的產量。每毫克磁珠通?？膳c1-20μg靶蛋白結合。
1.將適量的珠子轉移到離心管中。將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全沉淀時，去除上清液。
2. 取下試管，加入5倍磁珠溶液體積的PBS緩沖液，通過震蕩重新懸浮磁珠，渦旋30
秒。將試管至于室溫環境1-3分鐘，再將管放在磁力分離器上1-3分鐘。當磁珠完全
沉淀時，去除上清液。
3.重復步驟2 兩次。
4. 向含有目標蛋白質的粗樣品中添加洗滌過的磁珠，并在室溫或所需溫度下溫浴1-2小
時（溫度越低，培養時間越長）。
提示：強烈建議進行滴定實驗以優化培養時間。因為孵化的時間太長可能會導致很高的背景。
5. 用5倍磁珠體積的PBS緩沖液或1M NaCl徹底清洗磁珠，直到280nm處洗脫液的吸光度接近背景水平（OD 280<0.05）。
提示：添加更高濃度的鹽、非離子洗滌劑和還原劑也可能會降低非特異性背景。例如，向洗滌緩沖液中添加NaCl（濃度為1-1.5 M）、0.1-0.5%的非離子洗滌劑，如Triton X-100或Tween-20，以及還原劑，如DTT或TCEP（我們通常使用3mM）。
6. 通過適當的方法，如低pH（2-4）、高pH（10-12）、高鹽、高溫、親和洗脫或SDS-PAGE加載緩沖液中煮沸，洗脫目標蛋白。
7.切斷二硫鍵
提升：由于配體之間的構象不同，用戶應確定最佳工作條件，如還原劑、pH值和溫度，以切割單個配體的二硫鍵。以下是從磁珠上切割共軛的GFP蛋白的示例。
1）在140 mMβ-巰基乙醇或5 mM DTT（二硫蘇糖醇）中孵育磁珠（30mg/ml）。
a. 在 100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 140 mM β-巰基乙醇條件下，室溫2小時或
者過夜孵育，或者在98℃條件下5分鐘。
b. 在100 mM Tris-HCl, pH 8.0, 50 mM EDTA, 5mM DTT條件下，室溫2小時或者過夜孵
育，或者在98℃條件下5分鐘。
